ترکیبات نگهداری لیپید در باکتری های دریایی

چهل باکتری دریایی (آبزی) استفاده کننده از روغن خام سایکر و تروفیک یا سایکروتروفیک یا سایکروتروفیل (به ترتیب Psychrophile , Psychrotrophic (که ‌اولی ‌نوشته می شوند) برای توانشان جهت تراکم سازی ترکیبات نگهداری لیپیدشان در سیتوپلاسم در طی پرورشی تحت شرایط محدود کننده نیتروژن،‌مورد تحقیق و بررسی قرار گرفتند. بیشترشان (73%) قادر به تراکم سازی لیپیدهای عظیمی نظیر اسیدهای پلی هیدروکسی آلکانوئیک (PHA) بودند در حالی که دیگر لیپیدها مانند استیرهای واکسن (موم) در دو ایزوله رخ می دادند. تراکم یا انباشتگی یا توده شدن PHA بطور غالب در دورهای پایین  20-4 ) طبق آنچه برای سه ایزوله نشان داده شد، رخ داد. میکروسکوپی الکترونی ضخائم پلی فسفات را که در دو ایزوله برای PHA رخ می دهد، آشکار کرد. سلولهای(1) Acinetobacter sp  (منبعد به صورت “A” می آید) ایزوله ، قادر به سنتز کردن و تراکم نمودن ضمائم لیپیدی در طی رشد بر استارت،‌اتانول،‌روغن زیتون ،‌هگزاد گانول و هپتادکان بودند. ترکیب و کمپوزیسیون ضمائم لیپیدی بر ترکیبات فراهم شده بعنوان منبع مرکزی ،‌بستگی داشتند. (سیترهای واکسن (موم = Wax ) واکیل گلیسرول ها اساساً در طی پرورش بر روغن زیتون رخ می دادند و در مقابل استرهای واکسن یا مومی و الکل های آزاد در طی پرورش بر هگزاد کانول رخ می دادند. کل اسیدهای چرب در سلولهای A  بالغ  بر میزانی تا 25% از وزن خشک سلولی در سلولهای رشد یافته بر روغن زیتون می شدند. اسید پالمیتیک (Palmitic Acid) اسید چرب اصلی در لیپیدها در طی پرورش بر هگزا کانون ،‌هپتا دکان یا روغن زیتون رخ می دادند به منبع کربن مرتبط بودند. (اسیدهای چرب حاضر در لیپیدهای تراکم، بگونه ای غالب و محاط از اسیدهای چرب باز غده مستقیم اشباع شده و اشباع نشده با طول زنجیره متغیر از 12 تا 18 اتم کربن ،‌تشکیل می شدند. تحلیل و آنالیز پروتئین های توام با لیپید دانه در سلولهای A پروتئین Kda 39 را به عنوان گونه پروتئینی غالب آشکار و واضح ساختند.

مقدمه

شرایط محیطی (محیط زیست) که در ساحل خلیج (در آرژانتین)‌ San Jorge رخ میدهند، با دمای آب دریا تقریباً  5 و  15 ( به ترتیب) در فصل زمستان و تابستان و با درجه بالای آلودگی به واسطه نفت خام در برخی محلها با این اکوسیستم را برای ایزولاسیون میکروارگانیسم های و سایکروتروفیک و سایکروفیک (‌کننده در هیدروکربنی مطلوب می سازد. چنین ارگانیسم های منطبق شده با سرمایی قادر به بقا و قادر به رشد در محیط های سرد بوده که در بیشتر اکوسیستم های دریایی بوقوع می‌پیوندند. اینکه جمعیت میکروبی محیط های دریایی اغلب در معرض دیگر شرائط همانند موجودیت مواد مغذی قرار می گیرند. میکروارگانیسم ها انوع استراتژی هایی که اجازه بقای آن در این محیط های متغیر را می دهند توسعه می دهند که تراکم نگهداری لیپیدها ‌یکی از آنهاست. ترکیبات نگهداری بطور نرمان بصورت ضمائم فوق سلولی در باکتری ها رخ می دهند.

تراکم ضمائم لیپیدی توسط یک ایزوله در طی رشد بر انواع طبقات فرعی می پردازیم

مواد و روش ها : منبع میکروارگانیسم ها ،‌محیط ها و روش غنی سازی

رشته های بکار رفته در این مطالعه از نمونه های آب دریایی سطحی که از روغن خام استفاده می کند (بعنوان تنها منبع کربنی) غنی شده و ایزوله شده است. نمونه ها از ساحل خلیج San Jorge در آرژانتین در طی دسامبر 199 و ‌1993 جمع آوری شدند.

دماهای نمونه ها بین  5 و  15 متغیر بودند یک کلکتور یا گیرنده فلزی گرفته شده و در تمام اوقات در یخ حمل و نقل می شدند. تقریباً mml5 آب دریا توسط کلیتراسیون از طریق یک فیلتر استریل غشایی با اندازه‌روزانه  45/0 ،‌متراکم و کنسانتره شد. کنسانتره به سالین فیزیولوژیکی استریل ml50 اضافه شد و هم زده شد.

محیط معدنی (MSM) بنا به Schlege etal با ml5 از این سو از این سوسپانسیون آغشته شد (تلقیح شد) . پس از 7-5 روز از زمان تلقیح یا آغشته شدن در  7 این کشت جهت آغشتگی یا تلقیح پلیت های Msu/agar بکار رفت که حاوی روغن خام به عنوان منبع کربن بود و پلیت ها در  7 و  20 آغشته شد. (از ‌برای خلوص رشته های در حال رشد استفاده شد.

مورفولوژی ، آزمایشی بیوشیمیایی و رشد باکتری ها

ایزوله ها جهت کسب شناخت و هویت رده بندی مقدماتی تحلیل و آنالیز شدند. آزمایشات و رده بندی ها بصورت زیر است: شکل سلول، شکل کلنی و رنگ Gramstian ، Catalase اکسیداز، تست of اصلاح شده Liefsen و آزمایش API20E ایزوله 211 در DSMZ وارد شد که هویتش بعنوان یک گونه از  را تایید کرد و شماره کلکسیون 11042 DSMZ را بدست آورد. سلولها بصورت هوازی در  4 یا 20 در محیط  (گوشت) غذایی یا محیط نمکهای معدنی رشد یافتند که با 2% کلراید سدیم و منبع کربن مربوطه تکمیل شد. جهت مجاز داشتن تراکم لیپیدها، غلظت و تراکم کلراید آمونیوم در محیط معدنی تا 05/0% کاهش یافت. جهت کسب محیط جامد شده 8/1% agar اضافه شد. برای بررسی میکروسکوپی ضمائم لیپیدی سلولها با B  سیاه Sudan با بکارگیری سفرانین بنا به Burdon مورد مطالعه قرار گرفتند. کل فسفات توسط آزمایش اسپکترومتری طبق شرح Watanabe folsen تحلیل و آنالیز شد.

تحلیل و آنالیز اسیدهای چرب و PHA

جهت تعیین محتوای PHA یا اسید چرب سلولها و ترکیب مواد نگهداری اسیدهای چرب یا پلی استرها به اسید چرب تشکیل دهنده تغییر شکل یافتند. این اسیترها توسط کروماتوگرافی گازی با یک کروماتوگراف گازی مجهز به ستون ‌MX25 Perma Phase PEG و یک ردیاب یونیزاسیون شعله مورد تحلیل قرار گرفتند. نسبت  2 فاز ارگانیک پس از تقسیم تزریق تحلیل شد. هلیوم بعنوان گاز حامل بکار رفت . دماهای انژکتور و ردیاب  230 و  275 بودند. یک برنامه دمایی برای جدایی کارآمد استرهای متیل بکار رفت. به انضمام ردیابی استرهای متیل اسیدهای هیدروکسی آلکانوئیک این روش هم چنین اجازه ردیابی اسیدهای آلکانوئیک – n با 18-7 اتم کربن را می داد. اسیدهای چرب توسط قیاس مقادیر R_F اسیدهای چرب استاندارد مربوطه شناخته شدند. برای تحلیل کمی اسید ‌یا اسید تری دکانوئیک و اسید تترا دسنوئیک به عنوان استانداردهای داخلی بکار رفتند.

ایزولاسیون انضمام لیپیدی

انضمام یا ضمائم لیپیدی توسط سانتریفوژ کردن در گرادیانهای چگالی بنا باد Preastiny etal ایزوله شدند. سلولها در MSM با روغن زیتون بعنوان تنها کربن تحت شرایط محدودگر نیتروژن بمدت 96-72 ساعت در محیط ml 1000-500 پرورش یافته و سپس توسط سانتریفوژ کردن برداشت شده و در TRIS/HCL مجدداً معلق شدند. پس از عبور سه گانه از یک  ‌فرانسوی (Prench) ، عصاره های بدون سلول بدست آمدند و ml 3-2 برا بالای یک گرادیان ساکارز و زلود شد. گرادیانهای ساکاروز مقطع از هر ml 2 از 3/0 و 6/0 و 2/1 و M 2 ساکاروز در TRIS/HCL مهیا شدند. گرادیان در 4 بمدت 5 ساعت در g 170000 سانتریفیوژ شد. دانه ها یا گرده ها از گرادیان ها جمع آوری شده و متعاقباً توسط 20 دقیقه سانتریفیوژ کردن شسته شدند. ضمائم متعاقباً در معرض تحلیل شیمیایی و سولفات ‌سدیم قرار گرفتند.

میکروسکوپ الکترونی

سلولهایی که شسته شده و در بافر فسفات پتاسیم mM 50 معلق شدند با گلوتار آلدئید ثابت شده و در رزین با ویسکوزیته اندک Spurr گنجانده شد که طبق شرح Watheer – uanruschtetal است. بخشهای نازک ‌سرب کنتراست داده شده و در یک میکروسکوپ الکترونی فیلیپس در بزرگنمایی های کالیبره شده، بررسی شدند.

نتایج

چهل باکتری گرم – منفی متفاوت که از روغن خام بعنوان تنها منبع انرژی و کربن در ‌ پائین استفاده میکرونه از نمونه های آب دریای گرفته شده از ساحل خلیج San Jorge  تمامی این ایزوله های دریایی می توانند بعنوان سایکروتروف ها یا میکروارگانیسم های سایکروفیلی در پی تعریف Morita طبقه بندی شوند. بیشتر آنان می توانند در طیف حرارتی  30-0 رشته نمایند. رشته بیشتر رشته ها بر یونهای سدیم بستگی نداشتند گرچه در حضور 2% کلراید سدیم ‌رشد کردند. شور بودن یا نمک دار بودن آب دریای ساحل خلیج San Jorge بطور نرمال 5/3% است. هر چه که ایزوله ها غلظت های کلراید سدیم را تا 5% و در برخی موارد تا 5% و در مواردی حتی تا 8% تحمل کردند. بطور کلی مشخصات رده بندی ایزوله ها دشوار بود گر چه باکتری ها متعلق به  و Vibrio نهایتاً شناسایی شدند.

چندین مولف در شناخت باکتری هایی دریایی کارایی پایین را گزارش کرده و بسیاری آزمایش که برای میکروبیولوژی طبی طراحی شده برای باکتری های یافت شده در این محیط های آبی قابلیت کاربرد ندارند.

شکل گیری مجموعه های انضمام یا ضمائم لیپیدی

سلولهای ایزوله با B سیاه Sunon لکه دار شده و توسط میکروسکوپی نوری جهت تعیین کردن رخداد مجموعه های ضمیمه لیپیدی در سیتوپلاسم در طی پرورش تحت شرایط محدودگر نیتروژن بررسی شدند. هیدروکربنهای مثل آلکانها به انضمام لایه های فرعی غیر هیدروکربن مثل گلوکونات یا استات به عنوان تنها منبع انرژی و کربن برای رشد و برای سنتز لیپیدهای نگهداری مورد استفاده قرار گرفتند. ضمائم سلولی سلولها بعداً توسط کروماتوگرافی گازی (GC) و کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)  برای ترکیب شیمیایی شان تحلیل و آنالیز شدند.

ایزولاسیون و مشخصات شیمیایی ضمائم لیپیدی A.

عصاره های حاصله از سلولهای A. که به روغن زیتون پرورش یافته (به عنوان تنها منبع کربن) در یک گرادیان ساکاروز منقطع جدا شدند. پس از سانتریفوژ کردن ضمائم لیپیدی در اوج فاز M6/0 ساکاروز ظاهر شدند. مشخصات شیمیایی و تحلیل TLC آشکار کردند که ضمائم سلولی از یک ترکیب پیچیده از ترکیبات هیدروفوبیک تشکیل می شدند. استرهای واکس به عنوان اجزای اصلی به اضافه مقادیر جزیی از الکل های آزاد، تری اسیل گلیسرول ها، دی آسیل گلیسرول ها و اسیدهای چرب آزاد در ضمائم خالص شده ردیابی شدند. در مقابل ضمائم سلولی ناشی از سلولهای رشد یافته بر هگزادکانول فقط از استرهای واکس و الکل های آزاد با طول زنجیره مرتبط با طبقه با لایه فرعی طبق آنچه توسط TLC و GC آشکار شد. تشکیل شدند. پلی هیدروکسی بوتیرات یا دیگر PHA در ضمائم خالص شده ردیابی نشدند.

تحلیل و آنالیز الکتروفورز ژل ضمائم لیپیدی ناشی از A.

ضمائم لیپیدی ناشی از سلولهای رشد یافته بر روغن زیتون در یک ژل پلی آکریل آمید SDS توسط الکتروفورز جهت تحلیل و آنالیز پروتئین های توام با گرده یا دانه جدا شدند.

پروتئین ها از ضمائم ایزوله شده توسط تلقیح 5 دقیقه ای در 100 در حضور SDS قابل حل شدند. یک نوار پروتئینی عمده ارائه گر یک پروتئین تقریبا 39000 در تهیه ضمائم ردیابی شد. مضافاً اینکه برخی نوارها یا بانه های جزیی ارائه گر پروتئین های توده مولکولی کمتر نیز در ژل ظاهر شدند. پروتئین توام با ضمیمه 39000  بر غشاء VDF لکه دار شد و در معرض تنزل Erdmann اتومات قرار گرفت و رشته اسیدهای آمینه ترمینال N- 9 باقیمانده بدست آمد که بطور غالب از اسیدهای آمینه هیدروفوبیک تشکیل می شد.

مبحث:

میکروارگانیسم های ایزوله شده از خلیج San Jorge و مورد تحقیق و بررسی در این مطالعه در محیط های سرد باقی نماندند ولی قادر به رشد در دماها پائین بودند. برخی از ایزوله ها بسیار فرار بودند و در طيف وسیعی از دماها رشد کرده و شوری ها را تحمل کردند.

بیشتر ایزوله ها قادر به تراکم مقادیر متغیری از لیپیدها مثل پلی استرها یا استرهای واکس پس از پرورش تحت شرایط محدودگر نیتروژن بودند. با نگاهداری می تواند از بقای این باکتری ها تحت شرایط معکوس حمایت کرده و آنان را قادر به واکنش سریع وقتی شرایط مطلوب حفظ شوند، می نماید. برخی از میکروارگانیسم های مورد بررسی قادر به متراکم کردن بیش از یک نوع ماده حفظ کننده بطور همزمان می باشند مثل PHA و پلی فسفات. پلی فسفات نیز به عنوان رزرو انرژی در باکتری ها مدنظر قرار می گیرد. شرائط محیطی و مکانیسم های تنظیم گر شامل تعیین کردن رزرو اصلی وارد شده است. رخداد پلی استرها با دیگر ترکیبات لیپیدی به عنوان ماده نگهدارنده در سلولها بنظر می رسد ویژگی رخ دهنده باکتری های دریایی سایکروفیل بوده و بنابراین برای این باکتری ها از اهمیت زیادی برخوردار است. رخداد یک یا چند نوع از ترکیبات نگهداری در سلولها می تواند آنها را با مزیت ‌ برای بقای آن در محیط هایی با شرایط دارای نوسان تامین کند.

• چکیده
• مقدمه
• مورفولوژی ، آزمایشی بیوشیمیایی و رشد باکتری ها
• تحلیل و آنالیز اسیدهای چرب و PHA
• ایزولاسیون انضمام لیپیدی
• میکروسکوپی الکترونی
• نتایج
• شکل گیری مجموعه های انضمام یا ضمائم لیپیدی
• رابطه بین دما برای رشد و سنتز PHA
• رخداد پلی فسفات
• مشخصات ایزوله ۲۱۱
• ایزولاسیون و مشخصات شیمیایی ضمائم لیپیدی A.
• تحلیل و آنالیز الکتروفورز ژل ضمائم لیپیدی ناشی از A.