جدا سازی محصولات طبیعی آبزی

اقیانوس ها در جهان بیش از 70% سطح زمین را می پوشانند و دارای بیش از 200000 بی بهره و گونه های جلبکی هستند . این ارگانیسم ها در جوامع پیچیده و در ارتباط نزدیک با دیگر ارگانیسم ها زندگی می کنند . چه به صورت ارگانیسم های ماکرو ( مانند جلبک ، اسفنج ، نرم  تنان پوشش دار و یا به صورت میکرو ( مانند باکتریهای غیر رشته ای ، قارچ ها و آکتینوفایست ). بعضی از ارگانیسم ها مواد شیمیایی خود را از منابع غذایی به دست می آورند اگر چه مابقی آنها ترکیبات را دوباره سنتز می کنند . بعضی از ترکیبات ی توانند توسط میکروارگانیسم های مربوطه تولید شوند در حالی که مابقی آنها جهت تولید به یک ارتباط بین میزبان و میکروارگانیسم نیاز دارند . مواد شیمیایی یک نمونه خاص می توانند تحت تاثیر زیستگاه و عوامل فصلی و جغرافیایی باشد. در حقیقت منشاء واقعی بیوژنتیکی سنتز محصولات طبیعی آبزی ـ در جامعه این محصولات یک موضوع مورد بحث است.

به علت تنوع ارگانیسم های آبزی و زیستگاهها ، تولیدات آبزی طبیعی طبقات شیمیایی زیادی را احاطه می کنند ( مانند ترین ها ) شیمیکیمات ها  ، پلی کتیو ها ، استوژنین ها ، پپتیدها، آلکالوئیدهای ساختارهای متفاوت و یک دامنه ای از ترکیبات بیوسنتز مخلوط ، در دهه گذشته به تنهایی ، ساختارهای بیش از 500 محصول طبیعی دریایی به چاپ رسیده اند.

در بسیاری از موارد طبقه ترکیب موجود در ارگانیسم می تواند بر اساس طبقه بندی ارگانیسم منبع پیش بینی شود . متاسفانه حتی  شناخت علم به طبقه ترکیب همیشه ما را در جهت تعیین یک ساز خالص سازی هدایت نمی کند . مجموعه هایی از محصولات طبیعی آبزی می توانند دارای چندین عامل شیمیایی باشند ( مانند oso₃ – Na – Oac – och₃ – oh ) . هرگونه تغییر در عامل می تواند تغییر اساسی در قطبیت ترکیبات ایجاد کند بنابراین روش مورد نیاز برای خاص سازی نیز تغییر خواهد یافت . به عنوان مثال نمونه های اسفنج ته دریایی با جنس Spomhosorites دارای آبیس ( ایندول ) آلکالوئید است. تاپستین ( طرح 1 ) ، ساده ترین ترکیب این مجموعه میتواند با کروماتوگرافی هر ژل سیلیکا با استفاده از مخلوط های ckcl₃  – Meoh به عنوان شوینده ، خالص گردد . در الگاسیدین  d ( طرح 2 ) ک دارای یک زنجیره جانبی . 2- آمینو ایمیدازول است که خیلی قطبی تر است وبه کروماتوگرافی بر فاز ثابت فاز معکوس و شیشه شدن با مخلوط های اسید استونیتریل ـ آب ـ تری فلوئورو استیک ( TFA )  نیاز دارد . دراین حالت علم به طبقه ارگانیسم می تواند  در تعیین ساختار ترکیبات خالص کمک کند ولی در تعیین روش خالص سازی برای متابولیست قطبی تر که دارای یک عاملیت شیمیایی غیر منتظره است کمکی نمی کند.

به منظور دسترسی به بینشی در مورد روش هایی که بیشتر در خالص سازی محصولات طبیعی آبزی استفاده می شوند 115 گزارش از این محصولات که در سال 1995 در روزنامه انجمن شیمیدانان آمریکا ، روزنامه شیمی آلی ، تتراهدرون و روزنامه محصولات طبیعی به چاپ رسیده بودند مورد بررسی قرار گرفتند .

روش کلی مورد استفاده در HBOI

این فصل یک طرح کلی است از روش کلی مورد استفاده در آزمایشگاه  مولف جهت خالص سازی کردن محصولات طبیعی دریایی. یک طرح در شکل 1 آمده است . در روش ها تمام جداسازیها در یک مقیاس کوچک انجام می شوند تا این که ترکیب خالص به طور تکرار پذیر جدا شود. تعدادی روش خالص سازی برای تضمین جداسازی مقام ترکیبات مورد نظر استفاده می شوند و مقام اجزاء یا سنجض زیستی ، ILC-  و یا HPLC ، NMR شناسایی می گردند . روند کلی ما شامل مراحل زیر است :

1. جمع آوری و شناسایی میدانی ارگانیسم آبزی.
2. استخراج اولیه ارگانیسم .
3. سنجش بیولوژیکی عصاره استخراجی.
4. تقسیم جهت تایید و غنی کردن فعالیت زیستی .
5. تعیین قطبیت محصولات طبیعی موجود در عصاره و یا derplicatixn ترکیبات معلوم.
6. انتخاب اولین مرحله کروماتوگرافی بر اساس قطبیت.
7. کروماتوگرافی بیشتر.
8. توسعه جداسازی یک HPLC درصورت امکان .
9. افزایش مقیاس جداسازی برای آزمایش بیشتر بیولوژیکی و یا تشخیص ساختار.

کنترل ارگانیسم های آبزی

ارگانیسم های آبزی منبع هزاران محصول طبیعی مختلف هستند . بسیاری از این ترکیبات در سیستم های پستانداران بی نهایت سعی بوده اند. به عنوان مثال پالی توکسین که در ابتدا در زوآنتید Palythoa  toxica یافت شد یکی از مهمترین ترکیبات غیر پروتئینی کشف شد تا امروز می باشد . حوض جزر ومدی که در آن زوآنتید رشد می کند در شرح های اولیه سعی تشخیص داده شد و دانشمندانی که با آن ارگانیسم کار می کردند بیمار شدند و علائم شبیه آنفولانزا در طی مرحله جمع آوری وکارهای بعدی دیده شد.دیگر ترکیبات مانند میکا لامبد وآپلی سیاتوکسین بی نهایت مشکل ساز بودند آپلی سیاتوکسین همچنین دارای ویژگیهای قوی توسعه دهنده توموری است. به طور کل هنگام کار با هر ارگانیسم جدید ایمن تر آن است که فرض کنیم مقدار دقیق ترکیبات آبزی باید احتیاط و دقت کافی مبذول شود . وسایل محافظی مناسب مانند دستکش و یا حفاظ چشم باید همیشه استفاده شود. بسیاری از محققان ( مانند خود مولف) مواردی از ناراحتی شدید چشم داشته اندکه در کلی جمع آوری ارگانیسم ها به وجود آمده بود این در حالی بود که هیدروژنها واسفنج هایی مانند : Tedania   ignis    , VeoF : bularia  heitangere دارای مولفه های آزار دهنده زیادی هستند که باعث خارش و تشکیل دانه در بعضی افراد می گردند. به طور نمونه یک رویارویی با اسفنج NEOF : bularia  به تنهایی می تواند محققانی را که در آزمایشگاه مولف کار می کنند بر آن دارد تا هنگام کار یا نمونه ها از دستکش استفاده کنند . قویاً توصیه می شود که هنگام شنا و استفاده از لوله مخصوص تنفس یرای ارگانیسم ها از دستکش مناسب استفاده شود. اینجا می تواند از یک لباس مرطوب ( یا پوست غواصی ) و یا دستکش استفاده نمود ماسک های غواصی می توانند حافظ شخص باشند و شیشه های ایمنی و یا عینک های آفتابی می توانند حافظ شخص باشند برای کار در آزمایشگاه و جهت استفاده از ترکیباتی با خواص بیولوژیکی مجهول  باید از اصول استاندارد تبعیت کرد . باید مراقب باشید که در معرض  مستقیم ترکیبات قرار نگیرید هنگام ضرورت دستکش بپوشید ، با استفاده از هودهای شیمیایی کار کنید از تماس ترکیبات با پوست جلوگیری کنید ، از نمونه ها قورت ندهید و آنها را به طور مستقیم بو نکنید . اگر به دلایلی نمونه را باید بو کنید (‌مولف توصیه می کند که این کار را نکنید) از موارد احتیاطی شیمیایی طبیعی استفاده کنید و بخار را در جهت بینی خود به حرکت در آورید تا از مقدار آسیب کاسته شود.

ذخیره ارگانیسم های آبزی

ارگانیسم های آبزی اغلب در محل های متروکی جمع آوری می شوند که تسهیلات آزمایشگاهی محدودی دارند . بسیاری بلافاصله در رویایی با هوا می میرند و به سرعت تجزیه می شوند. ترکیبات یافت شده در ارگانیسم ها می توانند به سرعت با فرآیندهای اکسیداسیون ، آنزیمی و یا پلیمریزاسیون تجزیه شوند بنابراین ارگانیسم ها باید بلافاصله خشک شوند و یا منجمد گردند تا تخریب شیمیایی کاهش یابد. ترکیبات موجود در بعضی ارگانیسم ها مانند  اسفنج های Verongid می توانند بلافاصله هنگام لمس تخریب شوند و پلیمر می کردند. این با تغییر رنگ سریع از سفید و زرد  و یا نارنجی به آبی تیره قابل مشاهده است حتی وقتی که آنها در آب دریا حفظ شوند.

بسیاری از گروههای ارگانیسم ها را بلافاصله بعد از جمع آوری در –20c منجمد می کنند و آنها را در حالت انجماد نگه می دارند تا این که عملکرد بیشتر انجام شود. در بعضی وارد ارگانیسم ها در یک الکل قرار می گیرند مانند متانول ، اتانول و یا ایزوپروپانول . بعد از آن ارگانیسم حفظ شده در دمای اتاق و یا در یک فریزر نگهداری می شود. بعضی از ارگانیسم ها و جلبک ها اغلب در معرض هوا خشک می شوند و سپس در دمای اتاق و یا در فریزر ذخیره می شوند. تا اقدامات بعدی صورت گیرد . آگر تسهیلات موجود در دسترس باشند نمونه ها می توانند بلافاصله بعد از جمع آوری خشک فریز گردند وسپس در دمایی اتاق و یافریزر ذخیره شوند .یک گروه که در آزمایشگاه میدانی با تسهیلات  محدود کار می کرد ارگانیسم را به مدت 24 ساعت در ETOH-H₂O / 50 –50 فرو برد. این محلول بعد از آن قارچ شد . ارگانیسم ها در پلیمرهای Nalgene قرار گرفتند و به آزمایشگاه وطن برگردانده شده ودر دمای محیط قرار گرفتند.

برنامه ریزی برای روش جداسازی

سیستم جداسازی مورد استفاده تا حد زیادی به قطبیت ترکیبات مورد نظر بستگی دارد . تعدادی روش برای تعیین قطبیت محصولات طبیعت موجود در عصاره ها استفاده می شود. روش هایی که در HBOI استفاده می شوند عبارتند از تقسیم بین حلال های آبی و آلی ، تحلیل کروماتوگرافی لایه نازک با شوینده هایی با قطبیت متفاوت و شناسایی مقیاس کوچک خواص کرومات گرافیک.رفتار ترکیبات فعال بیولوژیکی در هر روش با سنجش زیستی اجزاء حاصل دنبال می شود . یا با بیولوتوگرافیکی مستقیم در حالت TLC .

بیولوتوگرافی

یک روش عالی برای شناسایی مولفه های زیست فعال من جمله قطبیت آنها بیولوتوگرافی است ( در فصل 1 و 7) . اگرچه رایج ترین شکل اوتو بیوگرافی ترکیبات ضد میکروبی را کشف می کند این روش برای کشف ترکیبات ضد تو موری نیز به کار می رود . در بیواتوگرافی صفحات لایه نازک عصاره های  مورد نظر در مقایس با صفحات آثاری قرار می گیرند که میکروارگانیسم های مورد نظر بر آنها تم گذاشته اند . برای بیواتوگرافی در مقابل خطوط سلول تو مور‌، پوشش های آگار استفاده می شوند . صفحه TLC بعد از یک زمان کوتاه انکوباسیون حذف می شود و یا می تواند هر جای خود باقی بماند اگرچه صفحه سنجش برای رشد میکروارگانیسم در انکو باسیونه قرار می گیرد . بعد از یک زمان مناسب انکو با سیون یک منطقه مهار رشد در مقادیر   Rf ترکیبات فعال مشاهده خواهد شد . در آزمایشگاه مول‍ف 3 سیستم لایه نازک برای شناسایی قطبیت استفاده می شوند :

1. برای ترکیبات غیر قطبی : اتیل استات ـ هپتای ( 1 : 1)‌برصفحات سیلیکا
2. برای ترکیبات با قطبیت میانی : اتیل استات ـ متانول ( 1‌: 19 ) بر صفحات سیلیکا
3. برا ی ترکیبات محلول الی قطبی :  n ـ پروپانول ـ اتیل استات ـ آب ( 1 : 2: 7) بر صفحات ژل سیلیکا .

 افزایش مقیاس جداسازی محصولات طبیعی

اصطلاح  افزایش مقیاس در اینجا افزایش بازده محصول تفسیر می شود این نوع افزایش یا افزایش مقیاس عملکرد و یا افزایش غلظت محصول ماده آغازین به دست می آید.در مورد  ،این فصل افزایش  مقیاسی را ماکزیممی در نظر می گیرد که در یک محیط آزمایشگاهی به دست می آید بنابراین عملیاتهایی که به تسهیلات مقیاس فرآیند و کارشناسی مهندسی شیمی نیاز دارند. مستثنی می شوند. این فصل  با توجه به  متابولیست های ثانویه میکروبی می باشد ولی جنبه های زیادی از جداسازی می توانند برای محصولات گیاهی به کار روند. اگر چه تسهیلات مقیاسی آزمایشگاهی برای مقیاس های بالاتر عملیات در نظر گرفته می شوند. مانند به کار بری حجم های 5 تا 10 ،یک  میز  کار بالای 750mm برای ارتفاع استاندارد  900mm  ارجح خواهد بود .برای عملیاتی که به یک دودکش نیاز دارند یک نوع Walkin ( یعنی داشتن Benching قابل حرکت و قابل تنظیم )  به همین دلیل توصیه می شود . فرض برای است که تحقیر کننده 10-L و وسایل مربوط به پردازش محتواهای آنهابه مقیاس ماکزیمم آزمایشگاهی راحت می باشد.

دنبال کردن جداسازی محصولات طبیعی

منظور ما از (( دنبال کردن )) چیست ؟ فرض کنیم که محصول طبیعی که فقط جدا شده است مورد توجه است یعنی دارای فعالیت بیولوژیکی است که ارزش بررسی بیشتری دارد و می تواند یک ساختار جدیدی داشته باشد و یا این که به خاطر دلایل اکولوژیکی و طبقه بندی شیمیایی مورد توه باشد . در هر حال ما می خواهیم ترکیبات بیشتر ، آنالوگ ها و پیش ماده های بیوسنتزی و دیگر متابولیت های مربوطه بیشتری داشته باشیم . اگر ترکیب از نظر بیولوژیکی فعال باشد می توانیم به این ترکیبات مربوطه نظری بیفکنیم و داده های مربوط به ارتباط ساختار فعال را بدست آوریم زیرا ترکیباتی که فعالیت بیشتری دارند و پایداری شیمیایی و متابولیکی آنها نیز بیشتر است و از نظر تجاری موقعیت ثبت اختراع ترکیب اصلی با توصیف خانواده بزرگتر متابولیت ها مستحکم می گردد.

گذشته از روش های کلاسیک سنتزی تعدادی روش وجوددارد که ما به عنوان دانشمندان محصولات طبیعی از آنها استفاده می کنیم و می توانیم بدین طریق این جداسازی اولیه محصول طبیعی را انجام دهیم .

تحلیل و جداسازی محصول

تحلیل HPLC گرادیانی و جداسازی محصول طبق آنچه که برای آنالوگ های اسکوآلستاتین گفته شود انجام گردید . استفاده از LC-MS  شناسایی پیک ها را مطابق متابولیست های مربوطه با قطعیت بیشتری نسبت به LC  به تنهایی ، عملی ساخت . به علاوه MS نشانه ای است از این که چطور مولکول ها تغییر کرده اند . در کشت هایی که در آنها اسکوالستاتین متابولیزه شده است LC-MS  نشان داد که در بیشتر موارد تغییر شکل زیستی مستلزم افزایش اکسیژن و یا دی استیلاسیون بوده است . الگوی تحضیر نشان می دهد که این ها به ترتیب بر زنجیرهای جانبی و الکیل روی داده اند . جداسازی طبق توصیف زیر عنوان 1-3-5 صورت گرفت با این تفاوت که در مراحل نهایی وقتی تفکیک ترکیبات با گروههای هیدروکسیل بر 23 C  و 24 C  صورت می گیرد HPLC بیشتری مورد نیاز است .

• پیشگفتار ۵
• ۱-۱ : روش کلی مورد استفاده در HBOI 12
• 1-2 ـ کنترل ارگانیسم های آبزی ۱۳
• ۲-۲ :جمع آوری ۱۵
• ۳-۲ : ذخیره ارگانیسم های آبزی ۲۱
• ۳- استخراج ۲۲
• ۱-۳ : بی مهرگان ۲۲
• ۲-۳ : جلبک های بزرگ ۲۴
• ۳-۳ – طرح روند مورد استفاده در آزمایشگاه .مولف در HBOI 25
• 4-برنامه ریزی برای روش جداسازی ۲۷
• ۱-۴ – طرح های تقسیم ۲۷
• ۲ـ۴ : استخراج فاز جامد ۲۹
• ۳ـ ۴ : بیولوتوگرافی ۳۰
• ۵: کروماتوگرافی ستون ۳۱
• ۱-۵ : کروماتوگرافی ستون خلاء ۳۲
• ۱-۶ : شک و تردید در مورد طبقه بندی ۳۶
• ۲-۶ : خالص سازی ترکیبات محلول در آب : اثرات نمک ۳۷
• ۳-۶ – پلی آمین ها ۳۸
• ۴-۶ : ترکیبات دارای استر سولفات قطبی ۳۹
• ۵-۶ : محلولهای پیچیده متابولیسم های قطبی :‌ تولوم کالین ها / کرامبس سیدین ها / باتزلادین ها
• ۶-۶ : ترکیباتی با خواص کروماتوگرافی حساس به PH – آلکالوئیدهای پلی آکریدین ۴۴
• ۷-۶ – متابولیست های اثر استثنای ـ اسونجیستانین ها ۴۷
• ۸-۶ تولید میکروبی متابولیت های حاصل از بی مهرگان و گیاه ۵۰
• ۷-خلاصهبحث ۵۵
• افزایش مقیاس جداسازی محصولات طبیعی ۵۶
• ۲- سیستم های سنجش ۵۹
• ۳-توسعه تحضیر ۶۰
• ۱-۳ : مقیاس عملیاتی ۶۰
• ۲-۱-۳- : افزایش مقیاس ۶۱
• ۲-۳: پیشرفت در تحضیر جهت افزایش تیتر ۶۴
• ۱-۲-۳- توسعه محیط ۶۵
• ۲-۲-۳:طرح آزمایشگاه ۶۸
• ۳-۲-۳ : بهینه سازی شرایط تخمیر کننده : ۷۱
• ۴-۲-۳ :توسعه مرحله تخم ۷۳
• ۴ـ اثر پردازش پایین رود ۷۴
• توسعه فرآیند پایین رود ۷۶
• ۱-۵ – داده های اولیه ۷۶
• ۲-۵ – محصولات درون سلولی ۷۷
• ۳-۵ : تولیدات خارج سلولی ۷۸
• ۴-۵ : خالص سازی محصول ۸۱
• ۶ خلاصه بحث ۸۵
• ۱- دنبال کردن جداسازی محصولات طبیعی ۸۶
• ۲-استخراج بیشتر : ۸۷
• ۱-۲ : طیف شبیه uv 87
• 2-2: شناسایی شیمیایی ۸۸
• ۳-۲ : اسپکترومتری جرمی و Lc-Ms 89
• 4-2 : جداسازی کامل ۸۹
• ۵-۲ : جداسازی مانیورهای اسکوآلستاتین ۹۱
• ۲-افزایش بروز ژن ۹۲
• ۲-بیوسنتزی بلوکی ۹۵
• ۱-۴ : جهش یافته های بیوسنتزی ۹۵
• ۱-۱-۴ : جهش یافته های بیوسنتزی پرادیمیسین ۹۶
• ۲-۱-۴ : جهش یافته های بیوسنتزی آکاراسینو مایسین ۹۶
• ۳-۱-۴ : آنالوگ های تریکوتسین ۹۷
• ۲-۴ : بازدارنده های آنزیم ۹۸
• ۲-بیوسنتز مستقیم ۹۸
• ۱-۵ :Mutasynthesis 100
• 2-5 : روش شناسی ۱۰۱
• ۲-۲-۵: تحلیل محصولات بیوسنتز مستقیم ۱۰۲
• ۳-۵ : بیوسنتز پیش ماده ای اسکو استاتین ها ۱۰۴
• ۱-۳-۵: روش ۱۰۶
• ۱-۴-۵ : A54745 110
• 2-4-5 : میتومایسین ها ۱۱۱
• ۳-۴-۵ :سیکلوسپورین ها ۱۱۱
• ۴-۴-۵: آورمکتین ها ۱۱۲
• ۵-۴-۵: تغذیه پیش ماده های طبیعی ۱۱۲
• ۶-۴-۵: هالوژناسیون ۱۱۳
• ۶- تغییر شکل زیستی ۱۱۳
• ۲-۱-۶: ارگانیسم ها ۱۱۶
• ۳-۱-۶: شرایط تغذیه ۱۱۹
• ۴-۱-۶: عوامل دیگر ۱۲۲
• ۲-۶ : تغییر شکل زیستی اسکوآلستاتین ها ۱۲۶
• تحلیل و جداسازی محصول ۱۲۷
• ۳-۶ – مثالهای دیگر تغییر شکل زیستی ۱۲۹
• ۱-۳-۶: آنتی بیوتیک های آنتراسیکلین ۱۳۰
• ۲-۳-۶: میلبمایسین ها ۱۳۱
• ۷- بیوسنتز ترکیبی ۱۳۳
• ۸ – سنتز ترکیبی ۱۳۵